Épidémiologie, écart héréditaire et annexion de l’pestilence à circovirus canin parmi les chiens atteints de maladies respiratoires

bétail et intellectuelle

Un achevé de 190 chiens, entrant à la coup des chiens en chanceuse caractère (n = 76) et les chiens incarnant des symptômes respiratoires (n = 114), ont été saisi là-dedans cette autopsie. La auscultation a évalué l’essuie-glace nasal (NS) et l’essuie-glace oropharyngé (OS) collectés compris janvier et brumaire 2020. Des échantillons ont été prélevés là-dedans le équipe florissant de chiens médicalement sains donc d’un détartrage dentaire de pratique au Veterinary Teaching Hospital, College of Veterinary Medicine, Kasetsart University, Bangkok , Thaïlande. Des chiens incarnant des appels respiratoires ont été prélevés sur des chiens approprié à des propriétaires qui ont visité l’ambulance d’pédagogie moyennant nourrissons troupeau, le Gymnase des sciences vétérinaires, l’Séminaire Chulalongkorn, Bangkok et les zones adjacentes, en Thaïlande. Les appels asiles des chiens comprenaient des éternuements, de la bronchite, des sécrétions nasales et une broncho-pneumonie diagnostiquée sur la armature d’une Afrique alvéolaire. Chiens incarnant des appels respiratoires causés par un aileron extrinsèque nasal, une inclination cardiaque ou une inclination trachéale fonctionnelle ; Les chiens présentent des maladies intestinales. Les chiens qui ont été vaccinés là-dedans les 4 semaines précédant l’aperçu ont été exclus.

Les avertisseurs de armature, y saisi le puissance, la étymologie, l’facture de upérisation et les appels respiratoires asiles, ont été enregistrés moyennant une narration surtout approfondie. L’âge des chiens a été classé identique suit : nourrissons chiens (moins de 1,5 ans), chiens adultes (âgés de 1,5 à moins de 6 ans) et grands chiens (âgés de 6 ans).42,43. Contre avancer le nécessiter virtuel virtuel de CanineCV là-dedans les maladies respiratoires, des chiens décédés de broncho-pneumonie organisé à des autopsies de pratique au Arrondissement de pathologie du Gymnase des sciences vétérinaires de l’Séminaire de Chulalongkorn ont été saisi là-dedans l’autopsie. Cette auscultation a été approuvée par le Congrès traditionnel de affermissement et d’manipulation des troupeau (IACUC) (n° 2031014) et le Congrès traditionnel de biosécurité (IBC) (n° 1931036) de l’Séminaire de Chulalongkorn. Cette autopsie a été rapportée selon aux directives ARRIVE.

Collection d’échantillons et arrachis d’ADN

Contre le lieu d’aperçu NS, des écouvillons (Puritan, Guilford, Récapitulations-Unis) ont été insérés là-dedans la naseau d’quasi 3 cm ou moins de proportion escortant la généalogie de dogue, lorsque que les OS ont été placés sur l’oropharynx tout autour des amygdales, après enroulés mielleusement. Les NS et OS prélevés sur entiers les chiens ont été immergés là-dedans une corrigé marais impuissant tamponnée au phosphate à 1 % (v/v), après aussitôt organisé à une arrachis du haploïdie à l’charité d’un kit d’arrachis d’ARN/ARN infectieux (Geneaid, Ltd., Taipei, Taïwan) selon aux recommandations du constructeur. stipulations. Les acides nucléiques anthologie ont été quantifiés et qualifiés sur la armature d’un parenté d’imbibition de 260/280 à l’charité d’un spectrophotomètre Nanodrop® Lite (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA). Les échantillons anthologie ont été conservés à -80°C jusqu’à à eux manipulation.

Un achevé de 15 poumons ont été obtenus de chiens mortuaires affligé de bronchopneumonie et divisés moyennant des dosages moléculaires et un écoute histopathologique. Contre la localisation moléculaire, le étoffe alvéolaire congelé a été haché, homogénéisé là-dedans du PBS à 1 % par un mélangeur de étoffe et clarifié par séchage à 10 000 ×g pendentif 3 minutes. Les surnageants d’arrachis du haploïdie ont été collectés identique utile ci-devant et stockés à -80 ° C jusqu’à ce qu’ils soient analysés. Le déchet des poumons a été fixé là-dedans du aldol inoffensif à 10 % à des fins pathologiques. Les tissus pulmonaires de chiens mortuaires décédés de maladies non respiratoires ont été saisi moyennant la localisation du CPCR, entrant des chiens affligé d’incompétence cardiovasculaire (n = 13) et de crise supplémentaire (n = 15).

Dépistage du incommode des maladies respiratoires infectieuses associées au toxine (CIRDC)

Ciguë respiratoires indécis, y saisi le toxine de la coryza crochet (CIV), le toxine de la coryza crochet (CPIV), le toxine de la deutérine crochet (CDV), le coronavirus respiratoire canin (CRCoV), l’adénovirus de marqué 1 et 2 (CAdV-1 et 2) et le toxine de l’herpès du dogue 1 (CaHV-1) a été projeté là-dedans des échantillons (NS et OS) provenant à la coup de chiens sains et des voies respiratoires, pourquoi que de tissus pulmonaires homogènes, en utilisant des tests multiplex de transcriptase antagonique (RT)-PCR/PCR identique décrit ci-devant.44. Les informations à propos de les tests CIRDC associés au toxine ont été utilisées moyennant une renseignement surtout approfondie.

Découverte crochet CV et redoublement débordante du haploïdie

Les acides nucléiques anthologie des quelques noyaux étudiés du haploïdie CanineCV ont été testés par PCR conventionnelle (cPCR) en utilisant le union Gotaq Vert Master (Promega, WI, USA) et des amorces uniques (F605-R1041 et F1022-R1538), moyennant une redoublement partielle. re ressurgir Et le cornettegènes (placard 4). La préliminaire de cyclage thermique consistait en une pollution majuscule à 95 °C pendentif 2 min, suivie de 35 cycles à 95 °C pendentif 30 s, 55 °C pendentif 30 s et 72 °C pendentif 30 s, et une développement dénouement à 72 °C. °C. °C pendentif 7 minutes. Contre consommer le haploïdie exécuté de CanineCV, discordantes paires d’amorces (F1349 ou F1372-R110 et F2014-R764) ont été utilisées moyennant accroître les séquences de CanineCV (placard 4). La préliminaire de cyclage thermique a été définie de la même contourné que celle-là décrite plus avant, à l’réserve de la temps de recuit, qui a été modifiée à 58 ° C pendentif 30 s envers un durée d’développement à 72 ° C pendentif 45 s. Le pointé catégorique CanineCV cPCR a été essence d’une brochure précédente27. Un pointé non-matrice (NTC) a été assidu identique pointé nenni. Les produits de PCR ont été séparés sur un gel d’agarose à 1,5 % (p/v) récipient du bromure d’éthidium et imagés en dessous aurore UV.

Étiquette 4 Amorces utilisées moyennant la localisation et le séquençage du cyclovirus canin à armature de CanineCV (CanineCV).

Contre corroborer les séquences nucléotidiques de CanineCV, les produits de PCR ont été purifiés à l’charité de NucleoSpin Extract II (Macherey – Nagel, Düren, Allemagne) et organisé au séquençage bidirectionnel Sanger (Macrogen Inc., Séoul, Corée du Sud). Les séquences originairement obtenues par approbation envers des génomes CanineCV ci-devant publiés disponibles là-dedans la armature de particularité GenBank ont ​​été analysées à l’charité de l’narration BLASTn. Contre la spécification débordante du haploïdie, discordantes produits du haploïdie provenant de discordantes cPCR envers des paires d’amorces uniques ont été visualisés, purifiés et organisé au séquençage Sanger identique décrit plus avant. Les séquences génétiques dérivées ont été originairement dynamitées à l’charité de séquences CanineCV précédentes déposées là-dedans GenBank moyennant corroborer la assistance de génomes CanineCV. Ultérieurement, les séquences génétiques dérivées ont été alignées et parlements à l’charité du soft BioEdit reprise 7.2 envers la embarras ClustalW.

Compagnie de CanineCV là-dedans les tissus par qPCR

Contre batailler la agréé bactérienne là-dedans changés tissus (placard adjuvant S6) de carcasses de chiens positives, une qPCR à armature de SYBR pelouse a été réalisée à l’charité du kit habituel KAPA SYBR® Fast qPCR Master Mix (2X) (KAPABIOSYSTEMS, Sigma-Aldrich, Plaid Town, prude du Sud ). La interférence consistait en une réflexion dénouement de 250 nM de quelque mobilier de défrichement (F247-R502) (placard 4), qui a été assidu moyennant accroître re ressurgir gène, donnant une épaisseur de contrecoup de 254 pb. L’redoublement a été désignée là-dedans un célérifère de PCR en durée matériel Rotor-Gene Q (Qiagen GmbH, Hilden, Allemagne) envers un stipulations de pollution primordial à 95 ° C pendentif 3 min couru de 40 cycles de 95 ° C pendentif 10 s et 60 ° C pendentif 30 s moyennant tenir une brillance herbeuse. Ultérieurement, une narration de la courbe de union a été effectuée moyennant décider la temps de union de l’amplicon. Un conquête catégorique devait fusionner compris 85,0 °C et 85,5 °C comme la temps incarnait augmentée de 60 à 95 °C. Le soft a rapporté un célérifère A aigre et fusionner A aigre au sujet de à NTC et un pointé catégorique récupéré à brusquement d’échantillons asiles positifs séquentiellement confirmés. La certificat Ct composition a été utilisée moyennant vénérer le flot de copies virales là-dedans quelque objet.

Histologie et analyses de crossing-over

L’végétal phylogénétique a été multiplication à l’charité du soft MEGA reprise 7.0. La procédure du maximal de véracité (ML), basée sur un modèle de durée unanime remplaçable (GTR) envers commercialisation gamma et sites stationnaires (G + I) envers 1000 répliques bootstrap, a été utilisée moyennant comparer la accointance compris les souches CanineCV obtenues et les hétérogènes. Souches déposées là-dedans la armature de particularité GenBank. De surtout, les alignements CanineCV ont été organisé à une narration de crossing-over à l’charité du soft Recombination Detection Program 4.0 (RDP4). RDP comprenait sept méthodes de localisation de crossing-over (RDP, GeneConv, BootScan, MaxChi, Chimera, SiScan et 3Seq) moyennant l’narration des points d’répit de crossing-over. La suite de crossing-over potentielle a été acceptée envers un s -valeur 10– dix d’au moins quatre des sept méthodes. Ultérieurement, les souches de crossing-over potentielles dérivées de l’narration RDP ont été soumises à un hyperbolique de analogie et à une narration Bootscan à l’charité du soft SIMPLOT vers Beta 4.94 moyennant corroborer en factice la assistance du lieu d’répit de crossing-over. Le soft a été vaste et analysé escortant les périodiques précédentes27.

Check-up anormal

Une coup que le étoffe alvéolaire charge a été fixé là-dedans du aldol oblitéré inoffensif à 10% pendentif 48 h, le étoffe a été traité et enrégimenté là-dedans de la frotté de onguent, contraire à 4 μm d’proportion et éblouissant envers de l’hématoxyline et de l’éosine (HE). Les résultats imperceptibles ont été examinés par un pathologiste vétérinaire certifié par le colloque thaïlandais (ST).

Mélange in situ (ISH)

Les poumons canins CV-PCR-positifs ont été étudiés surtout en justificatif moyennant le haploïdie CanineCV là-dedans les tissus par ISH. La drain inscrite à la digoxigénine (DIG) qui couvre 437 pb de micro-organismes canins re ressurgirLe gène a été produit en utilisant un kit de syllogisme de drain DIG PCR (Afrique Diagnostics, Bâle, Gardien) escortant le stipulations du constructeur. En simplifié, la drain CanineCV-DIG a été synthétisée envers les mêmes particularité de cyclage thermique décrites là-dedans la cPCR en microfraction. re ressurgirgène. Des oligonucléotides marqués au DIG ont été utilisés à la exercice des oligonucléotides fair-play. Ultérieurement, la drain coordonnée CanineCV-DIG a été observée en visualisant le capacité du contrecoup sur une électrophorèse sur gel d’agarose à 1,5 % (p/v).

Une coup les sections retirées et réhydratées, elles-mêmes ont été prétraitées envers 0,2 nitraté HCl (HCl) à temps ambiante pendentif 20 min, couru d’une corrigé de citrate (pH 6) à 95 ° C pendentif 20 min. Les lames ont été incubées envers 10 ng/ml de protéinase K (VWR, Radnor, PA, USA) là-dedans un trou Tris-NaCl-EDTA (TNE) 1X à 37 °C pendentif 20 min et trempées là-dedans une corrigé vague de formaldéhyde à 0,4 %. Ultérieurement, les lames ont été pré-hybridées envers un trou de pré-hybridation récipient 50 % (v/v) de formamide là-dedans une corrigé marais de citrate de sodium (SSC) 4X à 37 °C pendentif au moins 15 min, après incubées envers un trou d’interfécondité récipient 20X SSC, Amélioré de 5X Denhardt, 100 μg/mL d’ADN de graine de rose, 0,5 % (p/v) de dodécylsulfate de sodium et 10 ng de drain étiquetée CanineCV-DIG par portrait à 50 oC pendentif la nuitée là-dedans un couvoir de diapositives. Ensuite couvaison, les lames ont été fermement lavées là-dedans une rubrique de 2X SSC à 37 °C, 1X SSC à 42 °C et 0,5X SSC à 42 °C, chaque homme pendentif 15 min, respectivement. Les lames ont puis été incubées là-dedans 5% d’albumine de vaccin bovin (BSA) moyennant réunir la passade non exclusif à temps ambiante pendentif 30 min. Les réactions d’interfécondité ont été visualisées en incubant des analectes Fab anti-DIG-AP 1: 200 (Afrique, Mannheim, Allemagne) là-dedans un trou de frein 1X, et des avertisseurs chromogéniques ont été développés à l’charité de PermaRed / AP (Biodiagnostic Systems, CA, USA) appliqué en alcôve noire à temps ambiante pendentif 40 min. Ultérieurement, les lames ont été contre-colorées envers de l’hématoxyline. Les points rouges foncés affichés là-dedans le cytosquelette ont été considérés identique des résultats positifs, lorsque que la segment dénégation moyennant la PCR CanineCV et la drain non apparentée, la drain du bocavirus (CBoV) ont été considérées identique positives.45identique témoins négatifs.

analyses statistiques

Les associations compris la assistance de CanineCV et d’hétérogènes particularité variables, y saisi l’âge, le puissance, la généalogie, le règle de upérisation, la route d’aperçu, la co-détection envers les toxine CIRDC et les symptômes asiles des chiens échantillonnés, ont été calculées à l’charité d’un habitude du chi direct de Pearson ou de Fisher. . Un habitude en embarras de la épaisseur de la masse évaluée là-dedans quelque messager. Les particularité de insulte ont été considérées identique statistiquement significatives à un s-valeur < 0,05. L'odds division a puis été conscient moyennant batailler la apprêté de l'annexion compris quelque messager et l'effloraison de CanineCV. Les analyses statistiques ont été effectuées à l'charité de SPSS reprise 22.0 (SPSS Inc., Chicago, Illinois, Récapitulations-Unis).

Thèse d’déontologie

Les auteurs confirment que les politiques éthiques de la divertissement, semblables qu’énoncées là-dedans la adolescent des directives de l’concepteur de la divertissement, ont été respectées et que le assemblée de affermissement et d’manipulation des troupeau de l’Séminaire de Chulalongkorn (n° 2031014) a règlement l’ralliement du assemblée d’écoute déontologie accommodé. Toutes les procédures ont été effectuées selon aux directives et réglementations en dynamisme. Les auteurs soulignent que cette autopsie a été rapportée selon aux directives ARRIVE.

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